Mikroskop

Mikroskop
 
2.1  História mikroskopu
Za vynálezcov mikroskopu sa považujú holandskí výrobcovia okuliarov Hans Janssen a jeho syn Zacharias Janssen. Ich tvrdenia však nie sú príliš vierohodné, a preto sa za ďalšieho vynálezcu pokladá Galileo Galilei. Vyvinul mikroskop s konvexnou a konkávnou šošovkou. Christian Huygens, ďalší Holanďan, vyvinul koncom 17. storočia jednoduchý dvojšošovkový systém, ktorý bol neskôr achromaticky korigovaný. Hyugensov okulár sa vyrába dodnes. Má však, ako vieme, veľa nevýhod. Anton van Leewenhoek (1623-1723) sa často označuje za toho, kto ako prvý použil mikroskop v biológii. Tvorila ho iba jednoduchá šošovka. Jeho výhodou bolo, že jedna šošovka nemá toľko chýb ako zdvojené systémy. Až ďalších 150 rokov trvalo, pokým bol zložený mikroskop schopný poskytovať obrázky rovnakej kvality ako jeho jedna šošovka. V uplynulých 20 rokoch zaznamenala optická mikroskopia veľký rozmach. Je to nielen vďaka vysokej kvalite nových objektívov navrhovaných počítačmi, ale aj spojením mikroskopu s vyspelou videotechnikou a následným spracovaním obrazov výkonnými mikropočítačmi či laserovými zdrojmi svetla.
 
2.2  Typy mikroskopov a ich princíp činnosti
 
2.2.1 Optický mikroskop
Obyčajný optický (viď. obr14) mikroskop sa skladá z objektívu, ktorý vytvára zväčšený, prevrátený obraz skúmaného objektu, a okuláru, ktorým tento obraz pozorujeme ako lupou. Ďalšou časťou je zdroj svetla s kondenzorom. Skúmané predmety vidieť len vďaka tomu, že zobrazujúce žiarenie s nimi nejakým spôsobom interaguje. Svetlo môže byť pozorovaným objektom čiastočne absorbované, inokedy sa láme, odráža alebo rozptyluje, pri prechode objektom sa mení fáza svetelného vlnenia, niekedy aj jeho polarizácia. Niektoré objekty môžu emitovať tiež fluorescenciu. Skutočnú úlohu určitého optického javu, a tým aj vzhľad obrazu, však určuje voľba mikroskopickej techniky. Najpoužívanejšie sú: pozorovanie vo svetlom a v tmavom poli, fázový kontrast, diferenciálny interferenčný kontrast, Hoffmanov modulačný kontrast, interferenčná, polarizačná a fluorescenčná mikroskopia. Zložené optické mikroskopy môžu zväčšiť vzorku až 1000x. Pri štandartnom optickom mikroskope sú typické tri typy šošoviek: skenovacia (5x), nízke silné (10x) alebo stredné silné (20x) a vysoké silné (40x). pokrokovejšie majú aj štvrtú šošovku ponorenú v oleji.
 
2.2.2  Laserový rastrovací konfokálny mikroskop
Princíp činnosti: Pozorovaná vzorka je osvetlovaná bodovým zdrojom svetla. Tým je laserový lúč fokusovaný na clonku, ktorá je potom objektívom mikroskopu zobrazovaná na vzorku, do bodu s priemerom rovnajúcim sa rozlišovacej schopnosti objektívu. Tento objektív potom zbiera svetlo vzorkou odrazené alebo rozptýlené. Po spätnom prechode tohto sekundárneho žiarenia objektívom vznikne ďalší obraz bodovej clonky, ktorý je potom pomocou deliča lúčov lokalizovaný pred fotonásobič. Tu sa nachádza druhá konfokálna bodová clonka, blokujúca detekciu žiarenia pochádzajúceho z miest vzorky mimo roviny, do ktorej je mikroskop práve zaostrený. Obraz celej zaostrenej roviny získame jeho rastrovaním bod po bode, spôsobom, ktorý je v zásade podobný tomu, akým zväzok elektrónov vytvára obraz na televíznej obrazovke.

Pozorovanie trojrozmerných objektov: skutočné objekty však sú trojrozmerné, a preto majú aj konečnú hrúbku. Teoretické rozlišovacie schopnosti mikroskopu možno využiť len v prípade vzorky, ktorej hrúbka je menšia ako hĺbka ostrosti objektívu, ktorá závisí od numerickej apertúry. Pri skúmaní silných vzoriek je kvalita mikroskopu nepriaznivo ovplyvňovaná prekrývaním obrazu roviny, do ktorej je mikroskop práve zaostrený, s neostrými obrazmi rovín ležiacimi nad ňou a pod ňou. Rušivé zahmlenie obrazov žiarením z mimoohniskových rovín môžeme odstrániť pomocou konfokálnej mikroskopie.

Idea konfokálneho mikroskopu pochádza od Marvina Minského, ktorý ju patentoval v roku 1957. O desať rokov neskôr M.Petráň a M. Hadravský z LF UK v Plzni patentovali konfokálny mikroskop na báze rotujúceho Nipkowovho disku. Tandemový konfokálny mikroskop však nezožal v praxi veľký úspech. Éra konfokálnej mikroskopie začala až koncom 70. rokov. V súčasnosti existuje 10 verzií tohto mikroskopu.
 
2.3  Elektrónový mikroskop
Využíva namiesto svetla prúd elektrónov, ekvivalentný žiareniu s veľmi malou vlnovou dĺžkou. Zväčšený obraz vzniká dopadom elektrónov na fluorescenčné tienidlo alebo na fotografickú platňu. Obraz vzniká prechodom elektrónov skúmaným predmetom alebo jeho povrchu (odrazová mikroskopia), resp. sa vytvorí elektrónmi emitovanými z povrchu skúmaného objektu (emisná mikroskopia). V tomto mikroskope sú optické šošovky nahradené elektromagnetickými alebo elektrostatickými. V priestore, kde sa elektróny nachádzajú, sa musí udržiavať vysoké vákuum. Okrem elektrostatických a elektromagnetických šošoviek je tu i vákuová čerpacia sústava, zdroj stabilného prúdu pre magnetickú šošovku, resp. zdroj vysokého napätia pre elektrostatické šošovky. Elektrónový mikroskop dosahuje zväčšenie až 250000x. Prvý elektrónový mikroskop bol zostrojený v roku 1933 nemeckými fyzikmi: E.Rusk a M.Knoll.
 
2.4  Iné druhy mikroskopov
1. Ultramikroskop- pozorujú sa ním preparáty v tmavom poli. Predmet sa osvetľuje priamymi lúčmi, ktoré dopadajú kolmo na optickú os. V rovnorodom prostredí zostáva pole mikroskopu tmavé. Pri týchto pozorovaniach nemožno určiť tvar telies a ani ich veľkosť, existujú len ako svietiace body v temnom pozadí.
2. Fluorescenčný mikroskop- založený na poznatku, že niektoré látky po dopade svetla určitej vlnovej dĺžky žiaria svetlom inej vlnovej dĺžky. Fluorescencia sa vyvoláva zdrojom ultrafialového žiarenia, ktorým sa predmet osvetľuje.
3. Metalografický- slúži na zistenie štruktúry kovov a ich zliatin pri ich výskume.