Aktívne miesto enzýmu je oblasť, kde sa viažu substráty (a prostetická skupina, ak nejaká je) a obsahuje aminokyselinové zvyšky, ktoré sa priamo zúčastňujú pri prestavbe väzieb v substráte. Tieto zvyšky sa nazývajú katalytické skupiny. Napriek tomu, že sa enzýmy navzájom líšia štruktúrou, špecificitou a spôsobom katalýzy, je možné vysloviť niekoľko zovšeobecnení, čo sa týka týchto aktívnych miest:
1. Aktívne miesto zaberá relatívne malú časť celkového objemu enzýmu.
Väčšina aminokyselinových zvyškov enzýmu neprichádza do kontaktu so substrátom. Vzniká zaujímavá otázka: prečo sú enzýmy také veľké? Väčšina enzýmov je zložená z viac ako 100 aminokyselín, t.j. majú hmotnosť ~ 10 000 g/mol a priemer väčší ako 25 Å (1 Å = 10-10 m).
2. Aktívne miesto je trojrozmerná samostatná jednotka
Je vytvorená zo skupín, ktoré pochádzajú z rôznych časti lineárneho polypeptidového reťazca. Napríklad, aktívne miesto lyzozýmu je tvorené aminokyselinovými zvyškami 35, 52, 62, 63 a 101 z lineárneho polypeptidového reťazca zloženého zo 129 aminokyselín.
3. Substráty sú viazané do enzýmov mnohými slabými interakciami.
Rovnovážna konštanta pre komplex enzým-substrát (ES) je zvyčajne 10-2 až 10-8 M, čo zodpovedá interakcii od ~ –15 do –50 kJ/mol. Nekovalentné interakcie v ES komplexe sú oveľa slabšie ako kovalentné väzby, ktoré majú energiu od –250 do –450 kJ/mol. Reverzibilné interakcie medzi molekulami sprostredkovávajú elektrostatické interakcie, vodíkové väzby, van der Waalsove sily a hydrofóbne interakcie. Van der Waalsove sily sa prejavujú iba v prípade, ak sa množstvo atómov substrátu súčasne dostane do tesnej blízkosti atómov enzýmu. Preto enzým a substrát musia mať komplementárne tvary. Smerový charakter vodíkových väzieb medzi enzýmom a substrátom určuje vysoký stupeň špecificity tejto interakcie.
4. Aktívne miesta sa nachádzajú v štrbinách a priehlbinách.
Vo všetkých
známych enzýmoch sa molekula substrátu viaže do štrbín alebo priehlbín. Voda je zvyčajne vytlačená z týchto priestorov a v aktívnom mieste
sa nachádza iba v prípade, že sa zúčastňuje reakcie. Nepolárny charakter väčšiny väzobných miest zvyšuje afinitu pre substrát. Avšak,
aktívne miesta často obsahujú aj polárne skupiny. V tomto mikroprostredí niektoré skupiny získavajú špeciálne vlastnosti nevyhnutné pre
katalýzu. Prítomnosť polárnych skupín v aktívnych miestach porušuje pravidlo, že polárne skupiny sú v styku s vodným pro-stredím.
5. Špecificita interakcie závisí na presne definovanom usporiadaní atómov v aktívnom mieste.
Pre interakciu musí mať substrát vhodný tvar. Metafora Emila Fishera "kľúča a zámky", vyslovená v roku 1890, sa ukázala byť stimulujúca a veľmi plodná. Avšak, v súčasnosti je zrejmé, že aktívne miesta mnohých enzýmov sa výrazne modifikujú v dôsledku väzby substrátu. Aktívne miesto nadobúda komplementárny tvar až po naviazaní substrátu. Tento proces dynamického rozpoznávania bol nazvaný indukovaný fit a to Danielom E. Koshlandom v roku 1958.